復旦大學附屬中山醫院呼吸科 白春學教授

     肺癌是目前世界上最常見的實體瘤和最常見的癌癥死亡原因，盡管有多種第三代化療藥物投入臨床使用，但經手術、放療和化療等綜合治療后，其5 年生存率仍低于15%，迫切需要尋找新的治療手段和治療靶點。腫瘤分子靶向治療（molecular targeted therapy）利用腫瘤細胞與正常細胞間分子生物學上的差異，采用阻斷信號傳導通路、封閉受體、抑制血管生成等方法作用于腫瘤細胞特定的靶點，特異性地抑制腫瘤細胞增殖、侵襲和轉移，促進其凋亡。由于作用靶點的特異性，分子靶向治療比傳統化療具有更高的選擇性，毒副作用更小。目前，肺癌分子靶向治療藥物主要包括細胞生長因子受體抑制劑、血管生成抑制劑及信號傳導抑制劑等。

    一、以表皮生長因子受體（EGFR）為靶點的治療 

     由于腫瘤細胞的EGFR 及其下游信號傳導途徑調控失常，相當部分的腫瘤細胞存在EGFR 的過度表達并與與腫瘤細胞的惡性行為密切相關。約40%～85% NSCLC 患者肺癌組織標本中檢測到EGFR表達或高表達，高表達EGFR 者病變進展較快、放化療不敏感且預后差。針對EGFR 所開發并進入臨床研究的分子靶向藥物主要分兩類：（1）EGFR 酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKIs），抑制EGFR 胞內區酪氨酸激酶活性；（2）人工合成的單克隆抗體（MAb），與EGFR 胞外區結合，阻斷依賴與配體的EGFR 活化。上述藥物通過不同途徑阻斷EGFR 介導的細胞內信號通路，從而抑制腫瘤細胞增殖、侵襲、轉移和血管生成，并促進腫瘤細胞凋亡，提高其對放化療的敏感性。

     （一）EGFR 酪氨酸激酶抑制劑 <br> EGFR-TKIs 是一類能作用于細胞內表皮生長因子受體酪氨酸激酶區的小分子藥物，能抑制酪氨酸激酶磷酸化和下游信號傳導，目前應用于臨床的有吉非替尼（gefitinib，ZD-1839，商品名：Iressa） 和厄洛替尼（erlotinib，商品名：Tarceva）。

    1．吉非替尼：吉非替尼是第一個口服EGFR-TKI，于2002 年6 月在日本上市，2005 年2 月26日正式在我國上市，目前用于鉑類和紫杉醇化療失敗的晚期NSCLC 患者。它屬于苯胺喹唑啉類小分子化合物，通過與ATP 競爭細胞內EGFR 的ATP 結合位點來抑制EGFR 胞內區酪氨酸激酶（TK）磷酸化、阻斷酪氨酸激酶活性，阻斷EGFR 下游信號傳導而發揮抗腫瘤效應。 <br> 在2 項隨機、雙盲、多中心Ⅱ期臨床研究（IDEALⅠ和IDEALⅡ）中，共評價426 例使用含鉑類和/或多西紫杉醇方案化療失敗的NSCLC 晚期患者，有效率達8.8%～19%，癥狀緩解率達35%～43%。在2 項吉非替尼聯合化療一線治療（吉西他賓＋順鉑或紫杉醇＋卡鉑）NSCLC 的大型、隨機、多中心Ⅲ期臨床研究（INTACT1 和INTACT2）中，共分析2130 例晚期NSCLC 患者，結果顯示吉非替尼與化療合用并不能增加療效。評估吉非替尼是否延長肺癌患者生存期（ISEL）的Ⅲ期臨床研究結果顯示，與安慰劑比較該藥在延長患者生存期方面無統計學意義，但吉非替尼對東方人群或從未吸煙的人可明顯延長生存期。EGFR 基因突變對吉非替尼療效相關，中國臺灣NSCLC 中EGFR 基因突變率為38%，日本為32%，而美國僅為2%～10%，這種差異有助于從一定程度上解釋療效的差異；但新近研究表明即使在EGFR 基因突變者中也存在大量耐藥病例。

    Shah 等認為下列因素能增加吉非替尼的敏感性，從未吸煙者、病理為支氣管肺泡癌、女性、出生東亞。另有研究表明，使用免疫熒光原位雜交法（FISH）測定EGFR 基因拷貝數增加與患者對吉非替尼治療的反應、腫瘤進展時間和生存期密切相關，提示FISH 法測定EGFR 基因拷貝數是預測NSCLC患者使用吉非替尼療效的較好分子指標。

    2．厄洛替尼：厄洛替尼是另一種針對EGFR 的小分子TKI，與吉非替尼的結構和作用機制相似，2004 年11 月被美國FDA 批準用于NSCLC 治療。一項NSCLC 二線和三線治療的Ⅲ期臨床試驗中，731 例NSCLC 患者按2：1 比例隨機進行厄洛替尼（150mg/日）或安慰劑治療，結果發現厄洛替尼組總生存期為6.7 個月，較對照組4.7 個月顯著延長，同時厄洛替尼組生存質量明顯高于對照組。其中對293 例患者EGFR 表達進行檢測結果表明，發現它能顯著延長EGFR 陽性患者的生存期，而對EGFR陰性患者無明顯作用。這是第一個證實在化療后使用EGFR-TKI 能延長NSCLC 患者生存期的臨床隨機試驗，并且證實不吸煙、女性、腺癌患者對厄洛替尼治療更敏感。

    與吉非替尼類似，厄洛替尼治療最常見的不良反應也是皮疹和腹瀉，最嚴重不良反應是間質性肺疾病（ILD），其發生率約0.8%。如果出現ILD，應中斷厄洛替尼治療，并應采取相應的治療措施。厄洛替尼治療后出現皮疹的患者腫瘤緩解率較高、生存期較長，但這一點在吉非替尼臨床研究中尚存在爭議。 <br> （二）抗EGFR 單克隆抗體（MAb）

    西妥昔單抗（Cetuximab，商品名：Erbitus） 是人/鼠源嵌合的EGFR 單克隆抗體，作用于腫瘤細胞EGFR 的細胞膜外配體結合區，可阻止EGFR 與其配體結合。臨床前實驗結果表明，西妥昔單抗可通過抑制腫瘤細胞增殖、血管生成及促進凋亡等機制提高放化療的效果。Ⅰ期臨床研究顯示西妥昔單抗200-400mg/m2 單用或與化療聯合安全性好。Hanna 等報道的一項西妥昔單抗單藥治療復治NSCLC的研究中，可評價病例58 例，有效率4.5%、疾病控制率35%，中位生存期9.6 月，半年和1 年生存率分別為64%和39%，最常見的毒性反應是皮疹（77%）。Rosell 等評價了西妥昔單抗聯合化療（諾維本＋順鉑）治療初治NSCLC 的療效，86 例患者入組，92%為IV 期，加用西妥昔單抗組與未加用組總緩解率為31.7% 比20%，疾病進展時間為4.7 個月比 4.2 個月，中位生存期為8.3 個月比 7.0 個月，但均無統計學差異。因此西妥昔單抗聯合化療和放療在治療NSCLC 中的價值，仍需大樣本臨床研究進一步證實。 

     ABX-EGF 是一個高親和力的、完全人源化的抗EGFR 單克隆IgG2 抗體。Crawford 等進行了一項ABX-EGF 聯合紫杉醇＋卡鉑方案治療IIIB/IV 期、EGFR 陽性（＋＋或＋＋＋者）NSCLC 的開放、劑量升級的臨床試驗。入組19 例中1 例確認CR、4 例PR，最常見不良事件為皮疹（89%）。研究認為聯合治療方案可耐受，目前正進行進一步臨床研究。 

     （三）針對EGFR 的RNA 干擾 <br> 除EGFR-TKIs 和抗EGFR 單克隆抗體外，近年來采用RNA 干擾技術抑制EGFR 基因表達的研究也取得了可喜的進展。我們研究所利用RNAi 沉默NSCLC 細胞株中EGFR 表達后，成功抑制了腫瘤細胞的生長，并通過體內試驗進一步論證了靶向EGFR 的RNAi 抗腫瘤活性。 

     采用RNA 干擾技術，研究肺癌靶向治療的新策略。設計針對EGFR 基因的小干擾RNA 特異性序列，正義鏈：5‘-AAGGAGCUGCCCAUGAGAAAU-3‘ ；反義鏈：5‘-AUUUCUCAUGGGCAGCUCC-3‘；并利用化學合成小干擾RNA 初步驗證了其抑制EGFR 基因表達和肺腺癌細胞生長的效應。

    以此序列為基礎，構建靶向EGFR 基因的小發夾RNA（small hairpin RNA，shRNA）質粒表達載體。利用lipofectamine2000 將pShEGFR 載體轉入人肺腺癌細胞（human lung adenocarcinoma cell，HLAC）A549 和SPC-A1 中。轉染后2d，經定量PCR 檢測，pShEGFR對A549 和SPC-A1 中EGFR mRNA的抑制率分別達72.9%和81.0%；經免疫印跡檢測，EGFR 蛋白抑制率在轉染后6d 最高，在A549 和SPC-A1 中分別達74.1%和84.6%。質粒介導的shRNA 表達載體可在人肺腺癌細胞中產生RNAi 效應，下調EGFR mRNA 和蛋白水平的表達。pShEGFR 對A549 和SPC-A1 細胞的克隆形成抑制率分別為62.8%和68.9%。經流式細胞儀檢測，pShEGFR 使A549 和SPC-A1 細胞G0/G1 期比例顯著增加，S 期比例顯著下降，并促進A549 和SPC-A1 細胞凋亡；經Millcell 小室檢測，pShEGFR 顯著抑制A549 和SPC-A1 細胞遷移；經MTT 法檢測，pShEGFR 可將A549 和SPC-A1 細胞對順鉑、阿霉素、泰素的敏感性分別提高6.7 和6.0、5.5 和4.7、6.6 和6.4 倍。靶向EGFR 基因的shRNA 質粒表達載體能夠通過下調EGFR蛋白水平抑制肺腺癌細胞生長、遷移、促進細胞凋亡，并提高細胞對不同化療藥物的敏感性。

    將上述靶向EGFR 的小干擾RNA 發夾DNA 表達模板與穿梭載體連接。將穿梭載體和骨架載體共轉染293 包裝細胞，制備重組腺病毒（Adv-shEGFR）。Adv-shEGFR 體外感染肺腺癌細胞A549 和SPC-A1。定量PCR 檢測EGFR 基因mRNA表達變化：感染Adv-shEGFR 3d 后，對A549，SPC-A1細胞中EGFR mRNA 水平的抑制率分別達81.2%和79.8%。Western blot 檢測，感染Adv-shEGFR 3d和6d 后，對A549 細胞中EGFR 蛋白水平抑制率分別為52.3%和80.2%，對SPC-A1 細胞中EGFR 蛋白水平抑制率分別為45.5%和85.8%。體外感染病毒后的HLAC 進行動物接種，感染Adv-shEGFR 的A549，SPC-A1 細胞體內生長能力明顯受到抑制。

    建立A549，SPC-A1 裸鼠移植瘤模型，瘤內注射Adv-shEGFR，Western blot 測定腫瘤組織EGFR蛋白表達的抑制率分別為51.5%和44.8%。測量腫瘤體積繪制生長曲線，記錄腫瘤重量，計算腫瘤抑制率分別達62.8%和52.4%。靶向EGFR 的shRNA 重組腺病毒能夠有效實現動物體內核酸導入并產生RNAi 效應，通過下調HLAC 中EGFR 的表達抑制HLAC 的體內生長。

    二、以腫瘤血管生成為靶點的治療 

     腫瘤血管生成是腫瘤生長、轉移播散過程中極為重要的步驟，因而抗血管生成成為腫瘤藥物開發和腫瘤靶向治療的熱點。主要包括：以VEGF/VEGFR 為靶點的藥物、以血管內皮細胞為靶點的藥物、基質金屬蛋白酶抑制劑（MMPIs）等。

    （一）以VEGF/VEGFR 為靶點的藥物由于血管內皮生長因子及