蔡莉（綜述）　王婭蘭（審校）（重慶醫科大學病理教研室　重慶）

　　肝臟是許多惡性腫瘤常見的轉移器官之一，單發的轉移結節可以積極外科手術治療，但彌漫性的多發肝轉移結節缺乏有效的治療方法。近幾年來免疫治療、基因治療為肝轉移腫瘤的治療開辟了新的路徑。而白細胞介素12（IL-12）被認為是細胞免疫應答過程中的關鍵調節因子，具有明顯的抗腫瘤活性,已成為腫瘤免疫治療及綜合治療中的熱點。本文就IL-12的基本特征、抗腫瘤肝轉移機制及應用的研究作一綜述。

1 IL-12的基本特征  
　　IL-12最早發現于1989年[1]，當時被稱為NK細胞刺激因子(natural killer cell stimulatory factor, NKSF)。1990年，由EB病毒轉化的另一株B細胞（NC-37細胞系）培養液中發現了一種能誘導細胞毒型淋巴細胞分化成熟的物質，稱為細胞毒性淋巴細胞成熟因子（cytotoxic lymphocyte maturation factor，CLMF）。后來的研究證明，NKSF和CLMF的基因序列完全相同，為同一種細胞因子，統一命名為白細胞介素12(interleukin 12,IL-12)。
　　IL-12是由分子量分別為40 KD（p40）和35 KD（p30）的兩條肽鏈經二硫建共價連接而成的異二聚體糖蛋白。由于肽鏈上糖基化數量的變化，異二聚體的分子量變動于(70~75)×103之間，多數為70×103，故常以IL-12 p70表示IL-12的異二聚體形式。IL-12 p70是IL-12發揮生物學功能的基本分子結構，游離的p40和p30均不表現任何生物活性。產生IL-l2的細胞主要有兩大類：一類是參與先天免疫的細胞，如吞噬細胞、漿細胞及角質細胞；另一類是抗原遞呈細胞(antigen presenting cell，APC)，包括吞噬細胞的單核／巨噬細胞、B細胞以及樹突狀細胞（dendritic cell，DC）和皮膚郎罕細胞。
　　IL-12能顯著增強NK細胞和特異性細胞毒T淋巴細胞（cytotoxic t lymphocyte，CTL）的細胞毒活性；促進T細胞、NK細胞增殖；誘導Thl細胞的分化；刺激T細胞及NK細胞分泌多種細胞因子,特別是IFN-γ,能激活巨噬細胞的溶細胞膜的作用，能誘導干擾素誘導蛋白10(interferon inducible protein 10, IP-10)而發揮抑制腫瘤血管形成的作用，顯示出其在腫瘤的免疫治療中將起重要作用。

2 IL-12抗腫瘤肝轉移的機制
　　大量動物實驗表明，IL-12不僅能抑制腫瘤的生長，而且能抑制腫瘤的轉移，延長荷瘤動物的生存時間，但對IL-l2抗瘤作用在不同腫瘤中的細胞和分子機制各家報道不同。許多研究者發現T細胞是IL-l2抗腫瘤效應的必需物質。Chen 等[2]則認為IL-12的抗瘤作用主要通過CD4+T細胞產生的抗原特異性IFN-γ分泌增加實現。van Herpen  CM等 [3]在用重組人IL-12瘤內注射治療頭頸部鱗癌患者時，發現IL-12的抗瘤效應主要與誘導NK細胞在原發腫瘤內浸潤有關。而Xu 等[4]證明IL-l2的抗腫瘤效應需要NK細胞和CD8+T細胞共同參與。除腫瘤的免疫機制外，IL-l2對宿主內皮細胞有直接的抑制血管生成的作用[5]。
　　對于IL-12抗腫瘤肝轉移的作用機制，目前也沒有統一的結論。Kobayashi  [6]將IL-12注射到不同腫瘤分期（晚期伴肝轉移）的RL雄性BALB/c荷瘤小鼠模型中，在腫瘤晚期，裸鼠和胸腺正常小鼠的肝轉移均被明顯抑制，但IL-12在裸鼠中沒產生抗瘤效應。認為IL-12介導的抗瘤效應主要靠T細胞，而抗轉移效應主要靠NK和/或自然殺傷性T細胞(natural killer T cells，NKT)細胞, 一種特殊類型的T淋巴細胞，其除表達TCR和CD3等T淋巴細胞特有標記外，同時表達NK細胞系所獨有的抗原受體NK1.1、CD56和抑制性受體Ly49)介導。檢驗IL-12對這些細胞的直接作用，發現IL-12誘導的T細胞增殖在腫瘤早期明顯加強，晚期顯著下降，但IL-12誘導的被NK和NKT細胞介導的細胞毒活性在早期和晚期均未減弱，T細胞和NK和/或NKT細胞對IL-12的應答性在早期和晚期的不同解釋了IL-12在腫瘤晚期顯著不足的抗轉移效應。Shin T7則證明IL-12激活的Vα14 NKT 細胞而不是NK 細胞的過繼性轉移阻止了B16黑素瘤的肝轉移，同時NK細胞在IL-12介導的抗瘤效應中發揮的作用很小。在Vα14 NKT細胞介導的抗瘤活性的效應期,直接的細胞毒機制勝于細胞因子介導的免疫反應。但Park 等[8]對NKT細胞是IL-12介導的腫瘤排斥反應系統的必需細胞的觀點提出了挑戰，認為IL-12介導的腫瘤排斥反應機制復雜，與不同腫瘤所處的特定微環境有關。他們檢測和對比了經外源性IL-12給藥后NKT細胞、T細胞、NK細胞和其他γ-鏈依賴的非T非B細胞對小鼠B16黑色素瘤細胞的排斥作用，結果不支持NKT細胞在IL-12介導的腫瘤排斥反應中的必要作用，卻證實了NK細胞介導了肝轉移的排斥反應，這與肝臟內NK細胞的高頻率分布及其功能是一致的。
　　近幾年來，用重組腺病毒載體將IL-12基因轉移到肝細胞已被證明在小鼠中能抑制原發性和轉移性肝臟腫瘤，但抑制機制不明確。有研究[9]認為攜帶IL-12基因的腺病毒（adenovirus encoding IL-12,AdIL-12）抗肝轉移的抗瘤活性不依賴T細胞、NK細胞及NKT細胞，但在Miller等 [10]的實驗中，經AdIL-12治療的NK細胞失活的小鼠血清IL-12水平比NK細胞正常的小鼠升高了250倍,轉基因表達延長了接近兩周。分離這些經AdIL-12治療后動物的NK細胞，發現它們以溶解活性和IFN-γ分泌的方式被激活。將這種NK細胞過繼性轉移到未接受過治療的荷瘤小鼠身上，也明顯抑制了結腸直腸癌的肝轉移。表明AdIL-12抑制結腸直腸癌的肝轉移除了部分通過NK細胞產生的IFN-γ介導外，內生性IL-12的過度表達激活NK細胞亦參與了抗轉移過程。

3 IL-12抗腫瘤肝轉移的應用
　　IL-12在多種臨床前期動物模型中都表現出了抗腫瘤作用，但在體內使用IL-12有較大毒性反應。而用IL-12基因工程疫苗治療肝轉移毒副作用較小，成為目前研究的熱點，根據IL-12免疫基因治療的給藥途徑和方法主要分為體內基因治療、原位基因治療和離體基因治療：
　　3.1 體內基因治療 
　　體內基因治療是將目的基因載體注射到血液系統進行全身性基因治療。病毒載體傳遞法是最有效的傳遞重組基因至體細胞的方法之一。目前最常用的載體為重組逆轉錄病毒和重組腺病毒。
　　　　3.1.1 重組逆轉錄病毒   Alves 等 [11] 用單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV1-TK) 或更昔洛韋 (GCV)聯合攜帶IL-12基因的逆轉錄病毒治療大鼠DHDK12 結腸癌的多灶性肝轉移模型,不僅觀察到腫瘤體積明顯縮小,而且大鼠存活率顯著提高。在部分肝切除術后顯微鏡下有DHDK12復發的大鼠模型中，經逆轉錄病毒介導的IL-12基因治療后,再發腫瘤體積顯著縮小，生存率也明顯提高。這說明IL-12作為基因治療的佐劑有助于可切除或不可切除患者的治療。
　　　　3.1.2 重組腺病毒  有研究表明通過AdIL-12和抗-4-1BB的聯合治療可以根除小鼠結腸癌的肝轉移，但此療法對腫瘤面積大于8 mm× 8 mm的小鼠療效不佳。Pan等  [12]證明了活體內OX40與 CD4+T 細胞的結合誘導了在經AdIL-12、抗-4-1BB和抗-OX40聯合治療的大瘤負荷小鼠身上更高的CTL反應。該聯合治療得到的小鼠存活率比僅用AdIL-12與抗-4-1BB聯合治療的高，其長期存活的小鼠顯示了更高的對抗親代腫瘤的記憶性CTL反應。因此，用AdIL-12+抗-4-1BB+抗-OX40的聯合治療可能為與免疫抑制或耐受有關的晚期癌癥患者提供了一個更好的治療模式。
　　　　許多臨床前試驗表明低劑量的IL-12使CTL反應成為可能，但高劑量的人IL-12的重組體(recombinant human IL-12 ，rhIL-12)有明顯的毒力。Cebon 等[13]尋找并測定了rhIL-12與抗原肽聯合治療在更低劑量時的最佳生物劑量：在受試者為通過RT-PCR 或免疫組織化學表達黑素-A(Melan-A)來評價的III 或 IV期黑素瘤患者中，以10~100 ng/kg的劑量經皮下或靜脈注射的rhIL-12能被耐受。但近年來更多研究傾向于IL-12基因疫苗在腫瘤的局部應用。
　　3.2 原位基因治療  原位基因治療是將目的基因載體直接注射或導入體內的腫瘤組織，進行局部性基因治療。它因在增強局部腫瘤免疫反應使腫瘤消退的同時不會導致循環中高濃度IL-12而優于全身用藥。Jarnagin [14]用直接瘤內注射NV1042（一種有溶瘤細胞活性的載有IL-12基因的單純皰疹病毒復制品）的方法治療所建立的腫瘤模型，不僅使母瘤體積縮小，而且明顯降低了母瘤切除術后肝再發腫瘤的數量和再次給藥量。Gao等[15]將攜帶IL-12編碼的纖維-突變體腺病毒載體（IL-12-encoding fiber-mutant adenoviral vector ，AdRGD-IL-12）單次小劑量（2× 107 空斑形成單位）注射入Meth-A纖維肉瘤（對IL-12的全身用藥不敏感）小鼠的瘤內，誘導了明顯的抗瘤活性，并使該荷瘤小鼠的生存率顯著延長。免疫組織化學染色表明AdRGD-IL-12誘導了瘤組織內T細胞的聚集，且病毒載體瘤內給藥誘導的抗轉移效應與對抗同源腫瘤長期的特異性免疫一樣好。
　　3.3 離體基因治療 
　　立體基因治療是將目的基因在體外導入自體或異體來源的腫瘤細胞，免疫細胞或其他細胞，再將這些修飾過的靶細胞轉入體內。
　　DC是目前發現的功能最強大的APC，也是分泌IL-12的細胞之一。由DC激活的細胞免疫，特別是CTL介導的免疫反應，在機體抵御惡性腫瘤中發揮著十分重要的作用。Satoh等 [16]直接將IL-12 基因轉染的DC注入門靜脈明顯抑制了C57BL/6小鼠模型MC38結腸癌在肝臟的生長，并伴有CD4+、CD8+和NLDC-145+免疫效應細胞的瘤內蓄積，還導致了全身免疫反應，這種反應是由從脾和引流淋巴結分離的T淋巴細胞引起的IFN-γ分泌增強誘導的。對Cy3-標記的DC隨門靜脈灌注歸巢的評價證實了他們在肝臟和淋巴組織的分布。所以IL-12 基因轉染的DC的局部給藥不僅能在活體內抑制結腸直腸癌在肝臟的生長，而且能激發全身性抗瘤免疫反應。這條途徑很可能提高結腸直腸癌轉移的免疫治療效果,因為腫瘤相關DC的數量與更好的預后成正相關。同時局部基因治療將進一步提高臨床功效,使患者不用冒全身中毒的危險。
　　為獲得IL-12在腫瘤部位的局部表達而