崔  焱 馬雪梅 龔 浩 (首都醫科大學附屬北京友誼醫院 北京  100050）

【摘要】 目的  觀察血管緊張素Ⅱ對體外培養的肝星狀細胞（HSC）增殖的影響。方法  采用HSC-T6肝星狀細胞系作為活化的肝星狀細胞的研究模型。采用噻唑藍比色法檢測肝星狀細胞的增殖。采用3H標記胸腺嘧啶摻入法檢測肝星狀細胞DNA的含量。結果  血管緊張素Ⅱ(1Í10–10~1Í10–4 mol/L)各濃度組OD450值，均顯著高于對照組(P<0.05)。血管緊張素Ⅱ(1Í10–10~1Í10–4 mol/L)各濃度組3H-TDR摻入量cpm值，均顯著高于對照組(P<0.05)。結論  血管緊張素Ⅱ能夠劑量依賴性地促進肝星狀細胞增殖和DNA的合成。
【關鍵詞】 血管緊張素Ⅱ  肝星狀細胞  增殖
Effect of angiotensinⅡon proliferation of hepatic stellate cells .CUI Yan,MA Xue-mei,GONG Hao. Beijing Friendship Hospital Affiliate of Capital University of Medical Sciences, Beijing 100050  China;
【Abstract】  Objective  To investigate the effect of angiotensinⅡon the proliferation of in vitro cultured hepatic stellate cells.  Methods  HSC-T6 rat hepatic stellate cell line was chosen as the study model of the activated hepatic stellate cells. MTT colorimetric assay was used to evaluate the proliferation of HSCs. HSC DNA synthesis was evaluated by way of 3H-thymidine incorporation.  Results  OD450 value of angiotensinⅡgroups at concentration from 1Í10–10mol/L to 1Í10–4mol/L, was higher than that of control group(P＜0.05). Cpm value of angiotensinⅡgroups at concentration from 1Í10–10mol/L to 1Í10–4mol/L, was higher than that of control group(P＜0.05).  Conclusion  AngiotensinⅡ can increase the proliferation and DNA synthesis of hepatic stellate cells dose-dependently.
【Key words】AngiotensinⅡ; Hepatic stellate cell;  Proliferation
 
　　肝星狀細胞（hepatic stellate cell, HSC）受到致病因子的刺激而活化過渡到肌成纖維細胞（myofibroblast, MFB）進而成為活化的肝星狀細胞，這一過程稱為肝星狀細胞的激活。肝星狀細胞激活是肝纖維化發生發展的中心環節。活化的肝星狀細胞表現為細胞增殖明顯。
本實驗針對外源性的血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ, AngⅡ）對體外培養的活化肝星狀細胞的促增殖作用展開研究。

1 材料與方法
　　1.1 材料
　　HSC-T6肝星狀細胞系，由美國加利福尼亞舊金山總醫院肝病中心實驗室Friedman教授惠贈。血管緊張素Ⅱ為美國Sigma公司產品；DMEM（高糖型）、胎牛血清為美國Gibco公司產品；噻唑藍（MTT）為美國Sigma公司產品；3H標記胸腺嘧啶（3H-TDR）為英國Amersham Pharmacia Biotech公司產品，比活性1.0 mCi/ml。
　　1.2 主要儀器
　　美國Corning公司25cm2細胞培養瓶、 96孔細胞培養板；日本SANYO公司MCO-15A二氧化碳恒溫培養箱；美國Molecular Devices公司SPECTRA MAX 250 酶標儀；美國Beckman公司LS 6500液閃計數儀。
　　1.3 實驗分組
　　將96孔細胞培養板中的HSC-T6肝星狀細胞隨機分為8組：1組：對照組；2組：AngⅡ1Í10–10 mol/L組；3組：AngⅡ1Í10–9 mol/L組；4組：1Í10–8 mol/L組；5組：1Í10–7 mol/L組；6組：1Í10–6 mol/L組；7組：1Í10–5 mol/L組；8組：1Í10–4 mol/L　　　　組。組
均設3孔重復。
　　1.4 噻唑藍比色法檢測肝星狀細胞的增殖[1]
　　取對數生長期的貼壁細胞，用胰蛋白酶消化后，用含10%FBS的DMEM細胞培養液制成5×103個/ml的細胞懸液，接種于96孔細胞培養板中，每孔接種200μl，37℃，5%CO2條件下培養，待細胞貼壁后換液。對照組換不含藥物的培養液，實驗組換含不同濃度藥物的培養液，每組設3孔重復。
　　37℃、5%CO2條件下培養48 h，棄上清，每孔加入200 µl新鮮配制的含0.05% MTT的無血清培養液，繼續培養4 h，棄上清，加入200 µl二甲基亞砜（DMSO）將MTT甲替沉淀充分溶解，然后在酶標儀上測定450 nm處的光密度值。
　　1.5 3H標記胸腺嘧啶摻入法檢測肝星狀細胞DNA含量[2, 3]
　　取對數生長期的貼壁細胞，用胰蛋白酶消化后，用含10%FBS的DMEM細胞培養液制成5×103個/ml的細胞懸液，接種于96孔細胞培養板中，每孔接種200μl，37℃，5%CO2條件下培養，待細胞貼壁后換液。對照組換不含藥物的培養液，實驗組換含不同濃度藥物的培養液，每組設3孔重復。
　　37℃、5%CO2條件下培養48 h，將2 µCi/100 µl的3H-TDR加入細胞繼續培養12 h后棄去培養液，用0.125%胰蛋白酶消化，D-Hanks液漂洗，5 000轉/分鐘離心5 min后，棄上清，轉入甲苯閃爍液中，用液閃計數儀測定Cpm值。
　　1.6 統計學處理
　　采用SPSS for Windows 統計軟件對數據進行分析處理，多組間均數比較采用單因素方差分析，各組間均數的兩兩比較采用Student-Newman-Keuls法，P＜0.05認為差異有顯著性意義。

2 結果
　　2.1 MTT比色法檢測血管緊張素Ⅱ對肝星狀細胞增殖影響
　　MTT比色法檢測血管緊張素Ⅱ對肝星狀細胞增殖影響的結果見表1。

　　　　　　

　　以450 nm處的光密度值（OD450）反映活細胞的數目，即肝星狀細胞的增殖。結果表明，血管緊張素Ⅱ從1Í10―10 mol/L到1Í10―4 mol/L，各濃度組的OD450值比較對照組均明顯增加（P<0.05），除1Í10―7 mol/L和1Í10―6 mol/L兩組間比較差異無顯著性外（P＞0.05），其余各組之間兩兩比較差異均有顯著性（P<0.05）。說明在一定濃度（1Í10－10～1Í10－4 mol/L）范圍內，血管緊張素Ⅱ能夠促進肝星狀細胞的增殖，而且隨著血管緊張素Ⅱ濃度的增加，肝星狀細胞的增殖更加明顯，即呈劑量依賴性。
　　2.2 3H-TDR摻入法檢測血管緊張素Ⅱ對肝星狀細胞DNA合成影響
　　3H-TDR摻入法檢測血管緊張素Ⅱ對肝星狀細胞DNA合成影響的結果見表2。

　　　　　　

　　以3H-TDR摻入量（cpm值）代表細胞內DNA的含量，反應肝星狀細胞增殖的狀態。結果表明，血管緊張素Ⅱ從1Í10―10mol/L到1Í10―4mol/L，各濃度組的3H-TDR摻入量比較對照組均明顯增加（P<0.05），除1Í10―10mol/L和1Í10―9mol/L、1Í10―7mol/L和1Í10―6mol/L組間比較差異無顯著性外（P＞0.05），其余各組之間兩兩比較差異均有顯著性（P<0.05）。說明在一定濃度（1Í10－10~1Í10－4 mol/L）范圍內，血管緊張素Ⅱ能夠促進肝星狀細胞DNA的合成，肝星狀細胞增殖活躍，而且隨著血管緊張素Ⅱ濃度的增加，肝星狀細胞DNA的含量明顯增加，即呈劑量依賴性。

3 討論
　　HSC-T6肝星狀細胞系是由SV40轉染SD大鼠肝星狀細胞建立的永生細胞系，其表型為活化的肝星狀細胞，具有增殖的特性[4]。目前研究表明，它是進行有關活化的肝星狀細胞研究的理想模型。
　　血管緊張素Ⅱ是腎素-血管緊張素系統（renin-angiotensin system, RAS）分泌的主要生物活性物質。血管緊張素Ⅱ只有通過與組織細胞膜上的特異性受體結合才能發揮生物效應，主要是血管緊張素Ⅱ1型受體（angiotensinⅡ type 1 receptor, AT1R）。張藝軍等[5]應用RT-PCR技術檢測分離培養的大鼠肝星狀細胞表達血管緊張素Ⅱ1型受體mRNA，其PCR產物的測序結果與GenBank上AT1R cDNA序列有94%的一致性。Bataller等[6]發現在活化的人類肝星狀細胞表面也存在血管緊張素Ⅱ1型受體。這就決定了外源性的血管緊張素Ⅱ可以對肝星狀細胞發生作用。
　　目前研究發現，血管緊張素Ⅱ能夠促進活化的肝星狀細胞的增殖。Bataller等[6]報道，外源性的血管緊張素Ⅱ主要通過L型鈣通道，能夠劑量依賴性地引起體外培養的人類肝星狀細胞內Ca2＋濃度的升高，而細胞內Ca2＋濃度的升高是肝星狀細胞活化和增殖必不可少的條件。血管緊張素Ⅱ是活化肝星狀細胞的促細胞分裂劑，血管緊張素Ⅱ與血管緊張素Ⅱ1型受體結合，可以促進體外培養活化的人類肝星狀細胞的DNA合成和細胞增殖。汪余勤等[7]研究發現血管緊張素Ⅱ對肝星狀細胞的促增殖作用與細胞內Ca2＋濃度的升高密切相關，血管緊張素Ⅱ能夠劑量依賴性地促進體外培養的肝星狀細胞增殖。張藝軍等[8]實驗同樣發現血管緊張素Ⅱ可以促進肝星狀細胞DNA的合成和細胞的增殖。
　　本實驗結果表明，血管緊張素Ⅱ能夠劑量依賴性地促進HSC-T6肝星狀細胞的增殖和細胞DNA的合成，即血管緊張素Ⅱ對肝星狀細胞具有促增殖的作用。

參考文獻
[1]  陳非，鄧鴻業，鄧玉蘭，等.  MTT法分析肺泡MØ上清促纖維母細胞生長活性[J]. 免疫學雜志，1993，9(2)：127-130.
[2]  Vermijlen D, Luo D, Robaye B, et al. Pit cells(hepatic natural killer cells) of the rat induced apoptosis in colon carcinoma cells by the perforin/granzyme pathway[J]. Hepatology, 1999, 29(1): 51-56.
[3]  Runge DM, Runge D, Dorko K, et al. Epidermal growth factor and hepatocyte growth factor receptor activity in serum free cultures of human hepatocytes[J].