何曉松1　錢志英1　何流2　周曉明1　戴美紅1　張成陽3
（1江蘇省腫瘤醫院  江蘇省腫瘤防治研究所  江蘇 南京 210009；
2南京市江寧醫院  江蘇 南京 211100；3鹽城市腫瘤醫院  江蘇 鹽城 224003）

【摘要】 目的  建立實時熒光定量RT-PCR方法檢測survivin mRNA的表達。 方法  用Trizol方法提取食管癌組織總RNA后，將其逆轉錄為cDNA ，建立實時熒光定量RT-PCR 方法，檢測人食管癌 survivin mRNA的表達。結果  survivin mRNA在癌組織中高度表達，與正常食管粘膜有顯著性差異。 結論 所建立的實時熒光定量RT-PCR方法用于檢測檢測人食管癌survivin mRNA的表達，是一種快速有效﹑靈敏度高﹑特異性好的定量檢測方法。
【關鍵詞】 食管癌  實時熒光定量RT-PCR   survivin mRNA
Detection of surviving mRNA in esophageal cancer by real-time fluorescence quantitative RT-PCR；HE Xiao-song,QIAN Zhi-ying,HE Liu,et al.Department of Oncology，Cancer Institute and Hospital of Jiangsu，Nanjing，Jiangsu，210009 China
【Abstract】  Objective  To establish a real-time fluorescence quantitative RT-PCR.  MethodsTotal RNA was extracted with Trizol from the esophageal carcinoma tissues and mRNA was transcribed reversely into cDNA. The real-time quantitative RT-PCR was used to detect the expression of survivin mRNA. Results  The expression of survivin mRNA in the esophageal carcinoma tissues was significantly higher than that in the normal esophageal tissue. Conclusion  Real-time fluorescence quantitative RT-PCR used to detect the expression of survivin mRNA may be a reliable means for early diagnosis of esophageal carcinoma.
【Key Words】 Esophageal carcinoma; Real-time fluorescence quantitative RT-PCR; Survivin mRNA
 
　　Survivin mRNA 是近年來發現的一種新的凋亡抑制因子，屬于凋亡抑制蛋白( inhibitor of apoptosis proteins,IAP)家族的新成員，具有抑制細胞凋亡和調節細胞增殖的雙重作用［1］。Survivin 選擇性地表達于胚胎組織和人類大多數腫瘤組織，而在正常人終末分化組織中不表達［2，3］。對survivin 的分子生物學﹑組織分布特征﹑凋亡抑制機制及其于腫瘤的發生發展﹑細胞周期關系的研究已取得了一定進展。本研究擬建立實時熒光定量RT-PCR方法對食管癌組織測定survivin mRNA的表達水平。

1 材料與方法
　　1.1 材料 胃鏡下取食管標本52例，其中男性39例，女性13例。經病理組織學診斷：正常黏膜9例，侵潤性癌43例。

　　1.2 試劑和儀器 RNA提取試劑盒Teizol Reagant 為Invitrign公司產品，引物﹑熒光探針合成和PCR反應試劑盒由中山醫科大學達安基因有限公司提供，ABI Prisnxr 7000熒光定量PCR儀為美國PE公司產品。引物和探針設計參照文獻［4］。上游引物序列為：5′-TGCCCCGACGTTGCC-3′,下游引物序列為：5′-CAGTTCTTGAATGTAGAGATGCGGT-3′,探針序列為：5′-CCTGGCAGCCCTTTCTCAAGGACC-3′。

　　1.3 方法 
　　　　1.3.1 RNA提取  通過胃鏡下取食道黏膜組織，應用Teizol Reagant試劑盒，按說明書要求提取RNA，同時送病理做出組織學診斷。所提取的總RNA用紫外分光光度計測A280﹑A260定量并檢測其純度。A280／A260≥1.8為合格。所提取的總RNA經瓊脂糖凝膠電泳鑒定，可見明顯的28S﹑18S兩條區帶，證明其完整性。－70℃保存待用。
　　　　1.3.2 cDNA合成  20μl中含：總RNA 1μg，10×緩沖液2μl,dNTPs（10mmol/L）2μl,100ng隨機引物，M-MLV(10U/μl)2μl,加DEPC水至20μl。逆轉錄條件為：37℃ 55 min, 93℃ 3 min。
　　　　1.3.3 熒光定量PCR  50μl反應體系中含：1×定量緩沖液，dNTPs 200μl mol/L,5U ampliTaq Gold,survivin上下游引物各600 nmol/L,熒光探針200 nmol/L,100ng cDNA。反應條件為：50℃ 10s,95℃ 10 min,然后95℃ 15s,60℃ 1min,共42個循環。

　　1.4 統計學處理
　　用SPSS 11.0 For Windows 統計軟件進行統計學處理，采用單因素分差分析，P＜0.05有顯著性差異。

2 結果
　　2.1 Survivin陽性梯度標準品定量標準曲線制定及Ct值的測定Survivin 定量PCR標準品質粒的構建由中山大學達安基因有限公司完成，所得到的survivin標準品經紫外分光光度計定量，稀釋成不同的梯度濃度作為制備標準曲線的模板。以1×10～1×104不同稀釋度的標準品DNA模板進行熒光定量PCR擴增。從圖1可見，不同起始濃度模板（分別為101﹑102﹑103﹑104﹑105）進入PCR指數增長期的起始點即循環閾值（Cyle threshold,Ct）不同，拷貝數越大Ct值越小。同時也可見不同濃度的模板進入PCR平臺期后，PCR產物相差也比較大且不成比例。圖2顯示不同濃度標準品的Ct值與該標準品濃度的對數存在線性關系，起始濃度越高，Ct值就越小。統計學分析相關系數為1，線性關系極好。根據未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始mRNA水平。
　　　　　　　
　　2.2 Survivin mRNA 在食管癌及正常食管粘膜中的表達  實時熒光定量RT-PCR檢測survivin mRNA結果表明，43例食管癌標本的survivin mRAN表達為4.01±0.54(log copies/mg總RNA),明顯高于食管正常粘膜的1.23±0.26。二者比較，P＜0.05，有顯著性差異。

3 討論
　　Survivin在細胞中的生理功能非常主要，涉及到細胞周期的調控﹑細胞凋亡和腫瘤中血管的生成等。研究表明survivin是乞今為止發現的最強的凋亡抑制因子，最新的研究表明survivin抗細胞凋亡存在兩種途徑，一種是經典的caspases徑途，另一種是通過促進細胞分裂而抑制細胞凋亡［5］。與IAP家族不同的是survivin不僅抑制細胞凋亡，還參與對細胞分裂的調控。Survivin的表達具有細胞周期依賴性，在細胞周期的G2/M期選擇性地表達。在有絲分裂的開始，survivin與紡錘體的微管蛋白特異性結合，維護有絲分裂的正常進行。干擾survivin和微管蛋白的反應，可導致survivin抗凋亡活性的喪失［6］。血管形成確切地說取決于血管內皮細胞的生存凋亡平衡的結果。已有研究表明survivin參與了血管形成過程，在腫瘤血管增生過程中，血管內
　　皮生長因子（VEGF）與survivin存在正協同作用。VEGF的抗凋亡活性由內皮細胞所表達的survivin介導，而VEGA的存在是survivin作用所必需的條件［7］。研究證明,survivin作為一種新發現的凋亡抑制蛋白，在人類大多數惡性腫瘤中表達，具有強烈的凋亡抑制功能和促細胞增殖活性，并與腫瘤的血管生成和預后有密切的關系。
　　實時熒光定量RT-PCR不僅具有定性PCR的高靈敏度，而且由于熒光探針的應用，通過光電傳導系統直接檢測PCR擴增過程中熒光信號的變化而獲得定量結果。該方法采用完全閉管檢測，不需要PCR后處理，避免了交叉污染。具有良好的特異性和較高的靈敏度。該系統對PCR的每一循環進行實時監測，可準確地測定起始模板量的大小。該系統的自動化程度高，每次可對96個樣品進行分析。
　　Survivin的高度表達是大多數腫瘤的一個標志，Kato等[8]的研究結果表明survivin在食管癌中的表達明顯高于正常組織。本研究也證實了這一點，但我們采取實時熒光定量RT-PCR方法，可更為精確的反映survivin在腫瘤組織中的高度表達。我們期望對survivin在食管癌發生中所起的作用進行進一步的研究，能對食管癌的早期診斷﹑預后判斷有所幫助。

參考文獻
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