第三軍醫大學新橋醫院全軍腫瘤研究所 孫建國

Livin 是近年來發現的人類凋亡抑制蛋白家族的新成員，存在同基因不同剪切的兩種異構體：Livinα和Livinβ，二者不僅抗凋亡生物學功能有差異，而且具有不同的組織表達譜，在體內有復雜的作用機制。Livin 在人正常肺組織及癌旁組織中不表達或低表達，卻在非小細胞肺癌（NSCLC）組織中激活表達，并且經過化療的患者Livin 表達水平明顯升高，這可能是臨床上肺癌發生耐藥的機制之一。利用RNA 干擾（RNAi）技術阻斷Livin 基因表達，可望成為逆轉肺腺癌細胞化療抗性的良好策略。

分別設計針對Livinα＋β、Livinα和Livinβ的siRNA 作用位點，分子克隆法構建小干擾RNA（siRNA）表達載體，電穿孔法轉染SPC-A1 細胞及G418 抗性篩選后，分別建立Livin 異構體特異性基因沉默體系pSilencer-Livinα＋β、pSilencer-Livinα和pSilencer-Livinβ。體外實驗用甲基偶氮唑藍（MTT）法，根據細胞存活率繪制濃度效應曲線，確定半數抑制濃度（IC50），研究Livin 基因沉默后SPC-A1 細胞對氟脲嘧啶（5-FU）、甲氨喋呤（MTX）、環磷酰胺（CTX）、順鉑（DDP）、卡鉑（CBP）、多柔比星（ADM）、表柔比星（EPI）、足葉乙甙（VP16）、替尼泊甙（VM-26）和長春新堿（VCR）等化療藥物的敏感性改變；體內實驗利用荷瘤裸鼠模型，腹腔注射順鉑，根據化療前后腫瘤體積變化計算腫瘤抑制率，研究Livin 基因沉默后荷瘤小鼠對順鉑的敏感性改變。

經酶切鑒定和測序驗證，分別獲得針對Livinα＋β、Livinα和Livinβ的siRNA 重組載體，經基因轉染及G418 篩選后獲得穩定克隆，其中pSilencer-Livinα＋β和pSilencer-Livinβ的沉默效率達80%，pSilencer-Livinα的沉默效率約為60%。體外實驗，IC50 分析結果顯示，轉染細胞對不同化療藥物敏感性較對照組細胞明顯增強，其中，pSilencer-Livinα＋β組細胞對幾乎所有的化療藥物表現為敏感性增加（P＜0.01）；pSilencer-Livinα組細胞具有相似的效應，對多種化療藥物如MTX、CTX、CDDP、CBP、ADM、EPI 以及VCR 表現為增敏效應（P＜0.05）；而pSilencer-Livinβ組細胞則對VP16 和VM26兩種化療藥物表現出特有的增敏作用（P＜0.05）。體內實驗，對照組小鼠腫瘤生長潛伏期為5～6 天，實驗組小鼠生長潛伏期為7～8 天，當腫瘤長至8～10mm 時，給以腹腔內注射DDP，各組荷瘤裸鼠在給予化療藥物后第5 天、第10 天和第15 天移植腫瘤體積隨時間延伸而逐漸縮小，pSilencer-control 組腫瘤體積縮小最慢，pSilencer-Livinα＋β組腫瘤體積縮小最快，pSilencer-Livinα組與之接近，與pSilencer-control 組相比有統計學意義（P＜0.01），而pSilencer-Livinβ組腫瘤體積稍大，但仍然顯著小于對照組（P＜0.05）。pSilencer-Livinα＋β組，pSilencer-Livinα組和pSilencer-Livinβ組抑瘤率分別為146.1%、130.7%、110.5%。

實驗表明，Livin 異構體尤其是Livinα＋β可作為肺癌細胞化療增敏的分子靶點，其基因沉默有望成為肺腺癌基因治療新手段。